Introdução

O SARS-CoV-2 é um vírus de possível caráter zoonótico oriundo da família Coronaviridae. A infecção ocorre pela formação do complexo entre o sítio ativo da enzima de conversão da angiotensina 2 e a porção S1 da  proteína estrutural spike do vírus. As populações animais apresentam diferentes perfis de suscetibilidade, transmissibilidade e expressão de sinais clínicos. O diagnóstico laboratorial da infecção por SARS-CoV-2 pode ser conduzido por métodos diretos e indiretos. Os procedimentos técnicos para diagnóstico devem ser realizados por profissionais treinados e em laboratórios com nível adequado de biossegurança. Os testes de diagnóstico mais utilizados para detecção do SARS-CoV-2 são o RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa de amplificação em tempo real) e os sorológicos.

O SARS-CoV-2 é um agente viral oriundo de uma antiga ordem denominada Nidovirales, que abrange a família Coronaviridae, a subfamília Coronavirinae (coronavírus) e, por sua vez, o gênero classificado como Betacoronavírus.  Ao longo da história, os vírus dessa família foram responsáveis por inúmeros surtos, estando direta ou indiretamente associados à interação de seres humanos com espécies de morcegos. Entre os casos mais populares, na China, em meados de 2003, uma variante zoonótica foi descoberta envolvendo morcegos e furões como hospedeiros intermediários, sendo classificada como SARS (Severe acute respiratory syndrome). Ela levou a morte de mais de 770 pessoas, entre as 8.096 infectadas. Já em 2012 morcegos e camelos foram indicados como responsáveis pelo surto da Middle East respiratory syndrom (Mers), doença responsável pela morte de 2.220 pessoas desde o início do surto, e que uma vez mais demonstrou o potencial nocivo das enfermidades associadas à família Coronaviridae^1,2.

Em constantes buscas para compreender o histórico epidemiológico da Covid-19, descobriu-se que, de todas as sequências genéticas já descritas de coronavírus, o SARS-CoV-2 viria a ser o mais próximo dos coronavírus de morcegos (RaTG13), apresentando 98% de similaridade com ele. Por outro lado, afirma-se que o restante complementar apresenta similaridade com espécies de coronavírus de pangolins^3-6.

Pouco ainda se sabe sobre a suscetibilidade e a prevalência em animais domésticos e silvestres infectados pelo SARS-CoV-2. Contudo, há relatos de inúmeros casos – com e sem a presença de sinais clínicos – de animais cujos testes detectaram a presença de anticorpos ou moléculas do SARS-CoV-2 (Figura 1).

SARS-CoV-2 em seres humanos e animais

O novo coronavírus é capaz de realizar a invasão celular por meio da formação do complexo que envolve o sítio ativo presente na enzima de conversão da angiotensina 2 (ECA2) – expressa em células endoteliais e em vários órgãos, como: pulmões, coração, rins, testículos, fígado e intestino – e a unidade de superfície S1 presente na proteína estrutural S (spike) do vírus⁷. O processo de replicação se inicia após a formação do complexo S1-ECA-2, uma vez que este se torna alvo da metabolização pela serina protease transmembrana tipo II, a TMPRSS2⁸. Essa enzima cliva o complexo na altura do receptor, ativando a proteína S e viabilizando a entrada do vírus por meio do processo de endocitose. Uma vez no meio intracelular, ocorre o desnudamento do agente viral e de seu material genético (RNA de fita simples e cadeia positiva) por intermédio da maquinaria celular (ribossomos e organelas envolvidas nos processos de transdução e tradução de DNA), e ele passa a ser replicado. Com a intensa produção de proteínas virais, essas passam a ser expressas no retículo endoplasmático rugoso e, posteriormente, são enviadas para o complexo de Golgi, onde são encapsuladas e futuramente exocitadas^9,10.

A presença do sars-cov-2 nas células, associada à incapacidade do sistema imunológico para responder à infecção, resulta na destruição dos tecidos infectados que ativam intensos processos inflamatórios, repercutindo positivamente no processo de replicação viral, o que elucida o caráter citopático do SARS-CoV-2^9,11. Perante a predileção por tecidos que expressem ECA 2 e TMPRSSA mais intensamente, a eliminação do vírus do corpo do hospedeiro ocorre principalmente por meio de espirro, gotículas de saliva (facilmente disseminadas no ar e depositadas por todo o ambiente, com grande capacidade de sobrevivência no meio externo), catarro e tosse (transmissão de pessoa para pessoa). Além disso, estudos recentes afirmam que o acometimento do trato intestinal também é possível por meio de transmissão orofecal^3,9,12.

Os pacientes humanos sintomáticos apresentam alta taxa de transmissibilidade, associada a alterações sintomatológicas como tosse, febre, coriza, dor de garganta, dispneia, anosmia e ageusia, além de distúrbios gastrintestinais (náuseas, vômito, diarreia e anorexia leve)^11,13. Estima-se que 40% a 45% dos indivíduos infectados pelo SARS-CoV-2 sejam assintomáticos, apesar de apresentarem carga viral tão alta quanto os pacientes que desenvolveram sintomas, e podem transmitir o vírus como qualquer indivíduo contaminado¹⁴. Mesmo assintomáticos, alguns indivíduos apresentam comprometimento dos pulmões sem ter nenhum traço de doença respiratória, o que pode levá-los ao colapso repentino e à morte¹⁵.

Apesar dos inúmeros avanços de pesquisas relacionadas à infecção, à transmissão e a alterações de saúde em seres humanos, pouco se sabe sobre a transmissibilidade da doença em animais domésticos. Com relação aos gatos, aqueles infectados ocasionalmente, relatou-se que indivíduos que coabitavam os mesmos recintos não apresentavam panoramas homogêneos, ou seja, dentro de um mesmo grupo, alguns apresentavam testes negativos e outros positivos, podendo ou não ser assintomáticos. Os indivíduos sintomáticos, por sua vez, apresentavam quadros clínicos similares aos dos seres humanos, como diarreia, vômito, dispneia e febre^16-22. Enquanto isso, animais infectados experimentalmente apresentavam-se na maior parte das vezes assintomáticos, mesmo sendo capazes de transmitir a doença para seus semelhantes.

As mais variadas espécies de animais vêm sendo estudadas para que se obtenham informações sobre o grau de periculosidade de interação interespecífica. Em suma, até o presente momento, porcos, galinhas, patos e perus apresentam-se como espécies sem suscetibilidade, sem presença de sinais clínicos e incapazes de transmitir SARS-CoV-2. Os cães apresentam um histórico semelhante, apesar de terem uma suscetibilidade baixa e de já haver relatos de doentes sintomáticos e assintomáticos^23-27. Os gatos domésticos, assim como os tigres e os leões, já apresentam infecção natural (e experimental em gatos), alta suscetibilidade, expressão de sinais clínicos e capacidade de transmissibilidade²⁸. Os furões de espécies domésticas estudados experimentalmente apresentaram alta suscetibilidade e capacidade de transmissão, porém ausência de sintomas. Já os furões de espécies selvagens – como o visão-americano (Neovison vison) e o hamster-sírio (Mesocricetus auratus) – apresentaram infecção natural com presença de sinais clínicos^29,30. Por fim, os morcegos-da-fruta-egípcios (Rousettus aegyptiacus) também demonstraram alta suscetibilidade, ausência de sinais clínicos e capacidade de transmissão entre seus semelhantes de modo experimental, o que destoou da presença de sinais clínicos em estudos realizados com macacos (Macaca fascicularis e Macaca mulatta). 

Os animais de zoológicos vêm sendo estudados, uma vez que têm grande proximidade com o público e com os funcionários das instituições³¹. Em Nova York, tigres e leões do zoológico do Bronx apresentaram tosse seca e posteriormente os testes resultaram positivos para a doença^22,31-35.

Dessa forma, o conhecimento aprofundado a respeito da possibilidade de infecção ou contaminação oriunda da interrelação entre as diversas espécies animais, o ambiente e o homem pode auxiliar na construção de medidas de mitigação, bem como facilitar a eficácia de medidas de prevenção da doença. Por fim, é importante ressaltar que devemos sempre buscar a preservação da saúde e do bem-estar não só do homem como do meio ambiente e dos animais, pois qualquer desequilíbrio identificado nessas relações agrava contratempos como esse no qual vivemos atualmente^36,37. 

Testes diagnósticos para infecção e exposição ao SARS-CoV-2 

O diagnóstico laboratorial da infecção por SARS-CoV-2 pode ser conduzido por métodos diretos e indiretos. Embora exista maior precocidade e especificidade na detecção direta de partículas, antígenos ou material genético viral, os métodos indiretos identificam a resposta imunológica contra a infecção e permitem ampliar a possibilidade de diagnóstico após a fase aguda da doença³⁸.

A escolha da amostra correta é essencial para um diagnóstico confiável. Pode haver falso-negativos relacionados a carga viral muito baixa, coleta inadequada e falhas na amostragem, na manipulação, na conservação e no transporte até o laboratório³⁹. 

Os procedimentos técnicos para diagnóstico devem ser realizados por profissionais treinados e em laboratórios com nível adequado de biossegurança. O processamento de amostras para métodos não propagativos (não envolvem isolamento e multiplicação viral) como testes moleculares ou alguns sorológicos (Elisa, imunocromatografia e outros) deve ser conduzido em nível de biossegurança 2 (NBS-2), dentro de cabines de segurança biológica⁴⁰.

Os testes de diagnóstico mais utilizados para detecção do SARS-CoV-2 são o RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real precedida de transcrição reversa) e os sorológicos (método Elisa e imunocromatográfico, ou chamado teste rápido)¹⁵. O teste RT-qPCR é mais recomendado principalmente na primeira semana de sintomas, visto que detecta apenas infecções agudas (ou seja, quando há grande quantidade de RNA viral nas secreções de oro e nasofaringe) ou assintomáticas com o vírus ativo. Já os testes sorológicos do tipo Elisa detectam anticorpos de infecções após a segunda semana de sintomas, quando o indivíduo inicia sua produção de anticorpos IgM (sugerem infecção recente pelo vírus) ou IgG (são produzidos mais tardiamente e podem ser detectados por mais tempo após o término da infecção)^15,40. Os testes imunocromatográficos (testes rápidos) podem ser realizados nas mesmas etapas de infecção daqueles feitos pelo método Elisa (segunda semana de sintomas), entretanto, como a amostra é menor (punção digital), a sensibilidade pode ser afetada, sendo utilizados como apoio nos testes diagnósticos de primeira escolha ou no acompanhamento da progressão da doença^41,42.

Diagnóstico molecular – RT-qPCR

O método RT-qPCR (PCR em tempo real precedida de transcrição reversa) se enquadra como teste padrão-ouro para Covid-19, devido à elevada sensibilidade, à especificidade e à agilidade diagnóstica. Uma das principais vantagens desse teste em relação à sorologia é o melhor desempenho na detecção precoce de casos positivos em estágios iniciais da infecção, até mesmo durante o período de incubação da doença. A RT-qPCR permite a quantificação da carga viral detectada, que funciona como um excelente parâmetro para o monitoramento infeccioso. A detecção do RNA viral também pode ocorrer no paciente assintomático e em outros infectados que já tiveram resolução clínica^43,44. Dessa forma, é importante que os resultados sejam analisados com cautela. 

O diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 por RT-qPCR envolve estrutura laboratorial complexa e elevado custo atrelado. São necessários instalações específicas para biologia molecular, kits de extração de RNA, que podem ser manuais ou automatizados, primers e sondas (para detecção de alvos diferentes de SARS-CoV-2 e também de RNA da espécie hospedeira), controles, kits para reações de transcrição reversa e amplificação qPCR, termocicladores para PCR em tempo real e equipe altamente qualificada e treinada (Figura 2). O teste é recomendado entre o terceiro e o sétimo dias a partir do ínicio dos sintomas (fase aguda)³⁵, e se baseia na detecção de sequências únicas do RNA viral⁴⁵. Os genes virais alvo do SARS-CoV-2 são: N, E, S e RdRP, sendo a recomendação feita pela Organização Pan-Americana da Saúde (Opas/OMS)^45,46. Entretanto, no Brasil, o Ministério da Saúde recomenda como gene alvo o gene E, pela sensibilidade aumentada ao teste em relação ao gene RdRP, sendo usado como marcador de escolha^47,48.

As etapas do teste são: 
a) coleta de amostras (cotonetes estéreis de orofaringe e nasofaringe; o padrão seria a coleta de três cotonetes – um de cada narina e um de orofaringe); 
b) preparação das amostras em cabine de segurança classe II A2 (com filtro hepa), esgotando o material dos cotonetes no tubo falcon; após descartá-los, divide-se a amostra em dois criotubos sem conservantes; 
c) extração do RNA viral (seguida pela reação da transcriptase reserva para obtenção de DNA complementar a partir do RNA viral); 
d) amplificação do DNA obtido; 
e) leitura das placas com as amostras, usando equipamento termociclador; 
f) liberação dos resultados⁴⁴.

Os resultados considerados positivos são os das amostras que ultrapassarem o limite de fluorescência calculado pelo próprio software utilizado no exame (é feito o cálculo do CT – cycle threshold – a partir do número de ciclos no qual as amostras apresentam crescimento exponencial sem muitas alterações). Entretanto, as amostras consideradas negativas podem ser submetidas a maior quantidade de ciclos, e se ultrapassarem os limiares da fluorescência, podem indicar uma infecção inicial ou a latência do vírus no organismo⁹.

É importante considerar as limitações do teste RT-qPCR, mesmo sendo ele o padrão-ouro para detecção de SARS-CoV-2, pois alguns fatores podem levar a falso-negativos como: o tempo de infecção do animal (a amostra pode ter sido coletada em fase precoce ou tardia da infecção); a falta de sintomatologia indica baixo valor preditivo, porém não exclui a infecção; a metodologia de coleta dos cotonetes – contendo pouco material (podendo ser complicada em casos de coleta do animal sem sedação ou contenção adequada); o armazenamento; e o transporte das amostras^38,47. 

Testes sorológicos

Os métodos sorológicos vêm sendo utilizados principalmente para diagnóstico, mas também são aplicados para rastrear contato com o vírus e avaliar a imunidade de rebanho e a eficácia vacinal^49-51. A detecção de anticorpos é uma ferramenta interessante na investigação de pacientes com forte suspeita de infecção por SARS-CoV-2 e cujos testes por RT-qPCR foram negativos. A avaliação pareada em testes sorológicos aumenta o valor diagnóstico^20,52.

Esses testes são realizados com amostras de sangue total, plasma ou soro de animais suspeitos ou infectados a fim de se verificar o desenvolvimento de anticorpos IgG ou IgM específicos para infecção por SARS-CoV-2^45,53. Devem ser realizados a partir da segunda semana de infecção, visto que a carga viral estará baixando, pelo desenvolvimento dos anticorpos específicos que começarão a ser detectáveis nesse período. Os anticorpos IgM são geralmente relacionados a infecção recente da doença, ou seja, a partir da segunda semana de infecção, e os anticorpos IgG são relacionados à fase tardia ou pós-sintomática da doença, e podem ser encontrados no organismo por mais tempo após o término da infecção (meses ou anos; no caso da Covid-19, esse tempo ainda está em estudo)⁵³. O teste-padrão para detecção de anticorpos contra o vírus é realizado pelo método Elisa indireto (Enzyme-linked immunosorbent assay). O teste imunoenzimático demanda instalação laboratorial apropriada, com kits de Elisa específicos e validados, lavadora de placas, incubadora, espectrofotômetro para leitura de microplacas e equipe especializada (Figura 3). A metodologia baseia-se no uso de suporte sólido com antígenos virais já fixados, nos quais será adicionado o soro de teste. Se houver presença de anticorpos contra o antígeno desejado, haverá formação de complexo antígeno-anticorpo, que será reconhecido na etapa seguinte do teste, na qual um segundo anticorpo contra imunoglobulinas (chamado conjugado, pois está ligado à enzima peroxidase) é adicionado. Com a adição do substrato para enzima, as amostras positivas (ou seja, nas quais o complexo foi formado) desenvolverão coloração específica (método colorimétrico)^15,41. 

Como no teste RT-qPCR, as amostras dos testes sorológicos também precisam ser coletadas em determinadas fases da doença, visando evitar falso-negativos se coletadas antes de o sistema imunológico reagir ao vírus⁵³. Os testes sorológicos não devem ser usados como diagnóstico isolado para SARS-CoV-2, devido à detecção de anticorpos relativamente tardia, que não permitirá o isolamento do animal antes de a transmissão ativa do vírus ser encerrada ou em tempo hábil de tratá-lo corretamente durante a manifestação clínica da doença^45,53. Como opção mais acessível, temos os testes rápidos, que utilizam o método imunocromatográfico. O princípio geral consiste em adsorver antígenos virais na membrana do teste; assim, quando a amostra é adicionada, ela migra por capilaridade. Se a amostra for positiva, ocorre a formação do antígeno-anticorpo, que continua migrando pela membrana até a proteína de captura ser imobilizada, emitindo coloração (linhas de controle e teste). Os testes rápidos por imunocromatografia ganharam enorme aceitação, pela robustez, praticidade e agilidade. A detecção combinada de IgM e IgG corresponde à melhor escolha para sensibilidade e desempenho. Entretanto, as preocupações com resultados falso-positivos – e especialmente falso-negativos –  são maiores nessa abordagem. Os testes sorológicos com baixa especificidade podem representar um grande problema para o diagnóstico e a vigilância populacional de pacientes infectados^21,54. Uma das grandes desvantagens da sorologia é a baixa sensibilidade diagnóstica na fase inicial da doença. Existe um alto índice de resultados falso-negativos em seres humanos durante os primeiros 14 dias após o início dos sintomas^22,60. A janela de soroconversão pode muitas vezes inviabilizar o uso desses testes em pacientes clinicamente ativos, o que faz com que os métodos moleculares sejam muito mais indicados. A falsa percepção de que o paciente testado não está infectado produz consequências muito sérias para a disseminação e a contenção do avanço da doença.

Considerações finais

O SARS-CoV-2 é um vírus de transmissão entre seres humanos que eventualmente pode infectar animais domésticos, com manifestação de sinais clínicos e resposta imune variável. Nesse sentido, a compreensão dos métodos diagnósticos e a realização de estudos epidemiológicos que monitorem longitudinalmente a infecção e a exposição ao SARS-CoV-2 em cães e gatos de tutores com casos ativos de Covid-19 são importantes para o embasamento e o delineamento de medidas de prevenção e controle da Covid-19 em animais de estimação, como a quarentena, o isolamento do animal ou outras cabíveis. Nesse contexto, é importante ressaltar também a posição ocupada pelos médicos-veterinários clínicos, pois eles podem auxiliar na vigilância de casos de Covid-19 em animais de companhia, informando-os ao poder público e às instituições de pesquisa.

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